在基因編輯明星工具CRISPR的發(fā)明過程中，立陶宛科學(xué)家維吉尼亞斯·斯克斯尼斯（Virginijus ?ik?nys）領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)研究組經(jīng)常被忽略。

一直以來，美國加州大學(xué)伯克利分校的詹妮弗·杜德納和德國馬普協(xié)會(huì)感染生物學(xué)研究所的埃馬紐埃爾·夏彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）是媒體聚光燈下的中心。

直到2015年，博德研究所所長埃里克·蘭德（Eric Lander）就CRISPR基因編輯技術(shù)的發(fā)明過程總結(jié)了一篇“CRISPR英雄譜”，斯克斯尼斯的工作被廣泛了解。

2018年5月，斯克斯尼斯和杜德納、卡彭蒂耶共同獲得卡弗里納米科學(xué)獎(jiǎng)。

2018年9月，在挪威的卡弗里獎(jiǎng)?lì)C獎(jiǎng)典禮上，斯克斯尼斯接受了《知識(shí)分子》的專訪。

 

采訪 | LING

翻譯 | 王承志

責(zé)編 | 陳曉雪

 

●　●　●

 

如何進(jìn)入CRISPR領(lǐng)域

 

 

《知識(shí)分子》：感謝您接受我們的采訪。我們想通過這次機(jī)會(huì)向中國讀者講述您和CRISPR的故事。可以和我們說說您是如何進(jìn)入這個(gè)領(lǐng)域的嗎？

 

斯克斯尼斯：我在立陶宛維爾紐斯大學(xué)工作。我多年來研究細(xì)菌的抗病毒免疫系統(tǒng)?？共《久庖咴诩?xì)菌中非常重要，因?yàn)榧?xì)菌有個(gè)敵人——噬菌體。它就像細(xì)菌的寄生蟲。噬菌體需要進(jìn)入細(xì)菌才能復(fù)制。復(fù)制完成時(shí)，噬菌體通常會(huì)殺死細(xì)菌。細(xì)菌能夠存活，是因?yàn)樗鼈儠?huì)構(gòu)建多層防御，干擾噬菌體感染。

 

在我的實(shí)驗(yàn)室里，多年來我們使用X線結(jié)晶、生物物理和生物化學(xué)等多種手段研究細(xì)菌不同的抗病毒免疫系統(tǒng)。很長一段時(shí)間里，我們研究一些被稱為限制性修飾系統(tǒng)的防御系統(tǒng)。這些限制性修飾系統(tǒng)通常作為細(xì)菌的第一道防線，它們由兩種酶組成，限制性內(nèi)切核酸酶和甲基化酶。限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別入侵噬菌體DNA中的短核苷酸序列并切割DNA。而宿主DNA受甲基化酶保護(hù)，甲基化酶識(shí)別的序列被甲基化，從而使宿主DNA不被限制性內(nèi)切酶切割。

 

因此限制性內(nèi)切酶廣泛用于分子生物學(xué)。多年來，我們想要了解它們?nèi)绾螌?shí)現(xiàn)獨(dú)特的特異性，以及它們?nèi)绾巫R(shí)別DNA中的短序列。我們覺得，如果我們理解了限制性內(nèi)切酶如何實(shí)現(xiàn)其特異性的機(jī)制，也許就能夠設(shè)計(jì)出可以靶向任何DNA序列的新限制酶。雖然我們發(fā)現(xiàn)了一些限制性內(nèi)切酶識(shí)別特定序列的規(guī)律，但我們也意識(shí)到如果要改變這些酶識(shí)別的序列那需要做很多蛋白質(zhì)工程的工作。因?yàn)樗鼈兊陌邢驒C(jī)制是通過蛋白質(zhì)和DNA相互作用實(shí)現(xiàn)的。而且即使你能夠改變這些酶的特異性，大部分情況下它們識(shí)別DNA的能力比真的限制性內(nèi)切酶也相距甚遠(yuǎn)。

 

所以，我對這些改造蛋白質(zhì)的努力感到沮喪和厭倦，想找點(diǎn)新的事情干。2007年，《科學(xué)》發(fā)表了一篇文章，報(bào)道了細(xì)菌中一種叫做CRISPR的新的抗病毒免疫系統(tǒng)。我立刻對它產(chǎn)生了興趣，我覺得我應(yīng)該跳進(jìn)去做點(diǎn)研究。

 

這篇文章里描述的抗病毒免疫系統(tǒng)來自于一種叫做嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的細(xì)菌，這種細(xì)菌通常用來生產(chǎn)奶酪和酸奶。我聯(lián)系了這篇文章的作者，問他們是否可以提供菌株。我告訴他們我想研究這種細(xì)菌中的CRISPR系統(tǒng)，因?yàn)樗钟删w的機(jī)制這和我現(xiàn)在正在研究的限制性內(nèi)切酶系統(tǒng)很相似。但其分子機(jī)制還不清楚，我對CRISPR的分子機(jī)制的細(xì)節(jié)很感興趣。他們很慷慨地寄給了我菌株。

 

但是就像我之前說的，這種細(xì)菌通常用來生產(chǎn)奶酪和酸奶，而我的實(shí)驗(yàn)室并不懂如何生產(chǎn)奶酪和酸奶（笑）。所以我們考慮把嗜熱鏈球菌中的CRISPR系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中。每個(gè)人都熟悉大腸桿菌，而且大腸桿菌也是我們實(shí)驗(yàn)室干活的主力。

 

那么，問題來了。嗜熱鏈球菌里有4種不同的CRISPR系統(tǒng)，一個(gè)顯而易見的問題是我們的研究中該選哪一種。我們決定選擇其中一個(gè)被稱為CRISPR3的基因座進(jìn)行研究，這有兩個(gè)原因：一是這個(gè)基因座只有4個(gè)基因，所以這是個(gè)很小的系統(tǒng)。另一個(gè)原因是我們能夠識(shí)別出其中一個(gè)基因的特征，我們相信這是限制性內(nèi)切酶活性位點(diǎn)的特征。這一點(diǎn)很重要。

 

所以把這個(gè)CRISPR系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到了大腸桿菌里。讓我們驚奇的是，這個(gè)系統(tǒng)在大腸桿菌中也能保護(hù)大腸桿菌免受噬菌體的攻擊，如果這種噬菌體的基因序列在CRISPR區(qū)域有匹配的話。這是第一次證明了CRISPR系統(tǒng)是可以轉(zhuǎn)移的，你可以把CRISPR系統(tǒng)從一種生物里轉(zhuǎn)移到另一種生物里。這是個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)檫@證明它是有功能而且可以在物種間轉(zhuǎn)移。所以下一步就是把這個(gè)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到真核生物中。

 

所以顯而易見，下一個(gè)工作就是要理解這個(gè)系統(tǒng)在大腸桿菌中是如何工作的。在大腸桿菌中，你有很多種遺傳學(xué)工具可以使用，可以在CRISPR位點(diǎn)里一個(gè)一個(gè)地敲除基因，這樣就能理解哪個(gè)基因?qū)NA干擾功能是重要的。我們發(fā)現(xiàn)只有Cas9對于DNA干擾是重要的。所以我們嘗試從大腸桿菌里純化Cas9蛋白。純化以后我們發(fā)現(xiàn)了兩種RNA分子。其中一種就叫做CRISPR RNA。事實(shí)上，我們展示了Cas9在這兩種RNA分子的引導(dǎo)下，可以定位到入侵的DNA，并且Cas9可以產(chǎn)生導(dǎo)致DNA切割的雙鍵斷裂。所以到頭來，Cas9和限制性內(nèi)切酶一樣，也是識(shí)別一個(gè)靶標(biāo)DNA然后切割DNA。但有一個(gè)重要的不同，限制性內(nèi)切酶識(shí)別DNA是使用蛋白質(zhì)-DNA相互作用，而在CRISPR系統(tǒng)中，Cas9使用CRISPR RNA來識(shí)別靶標(biāo)DNA，顯然這讓重新編輯配對的序列變得異常容易。你只需要改變CRISPR RNA，就可以把Cas9帶到基因組上任何想靶向的序列。

 

這種易編輯的特性打開了基因編輯實(shí)驗(yàn)的大門，因?yàn)楝F(xiàn)在每個(gè)人都能編輯Cas9然后靶向基因組中任何序列。諷刺的是，我跳進(jìn)CRISPR是因?yàn)槲蚁氡苊庠傺芯肯拗菩悦?，但再一次的，這其實(shí)也是一種限制性酶，不過從功能上來說使用完全不同的機(jī)制。所以我覺得非常非常有趣。當(dāng)我們意識(shí)到Cas9的這種易編輯的特性，我覺得這為基因組編輯鋪平了道路。所以這幫助我繼續(xù)研究Cas9的分子機(jī)制。

 

當(dāng)然，我們可能不是世界上唯一對CRISPR和Cas9感興趣的課題組。事實(shí)上，確實(shí)有其它課題組也專注研究CRISPR和Cas9的分子機(jī)制。所以，這個(gè)領(lǐng)域就有了一定的競爭，不過這種競爭在科學(xué)界永遠(yuǎn)存在。

 

我們研究了Cas9工作的分子機(jī)制，然后當(dāng)然我們決定把成果發(fā)表出去。我們首先把文章送到了《細(xì)胞》（Cell）雜志，三天后我們就收到了《細(xì)胞》的回信，說他們不感興趣，他們甚至都沒有送審。這個(gè)回應(yīng)確實(shí)有點(diǎn)讓人沮喪，因?yàn)槲覀兿嘈胚@真的是一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)。所以我們又把文章投到了《細(xì)胞報(bào)道》（Cell reports）?！都?xì)胞報(bào)道》也不喜歡這篇文章，也沒有送審。所以我們只好做一些額外的工作把文章改成其它雜志的格式，最后決定把文章投到《美國科學(xué)院院刊》（PNAS）。過了一段時(shí)間，PNAS把文章送審了，但評審花了很久很久的時(shí)間。到了6月份，Jennifer課題組在《科學(xué)》（Science）上發(fā)表了那篇CRISPR的論文。結(jié)果她們成了最先發(fā)表這個(gè)成果的的課題組。雖然我們是最先投稿的實(shí)驗(yàn)室，但因?yàn)檫@個(gè)漫長的投稿過程而變慢了。她們的發(fā)表非常快，投到《科學(xué)》以后兩個(gè)星期文章就被接受了。

 

從基礎(chǔ)性研究到創(chuàng)新性應(yīng)用

 

《知識(shí)分子》：這個(gè)投稿歷程還是非常曲折的。

 

斯克斯尼斯：這就是我們的故事。不過我還是很高興現(xiàn)在領(lǐng)域已經(jīng)認(rèn)可了我們的貢獻(xiàn)。這也帶來很大的影響。首先，我們得到了很多媒體的關(guān)注；其次，你得到了解釋基礎(chǔ)科研和基礎(chǔ)研究重要性的機(jī)會(huì)，以及這些基礎(chǔ)研究如何產(chǎn)生突破性的應(yīng)用，就像在Cas9研究中發(fā)生的這樣。我們從研究細(xì)菌的抗病毒免疫系統(tǒng)開始，嘗試去理解細(xì)菌抵御噬菌體侵染最基礎(chǔ)的機(jī)制，結(jié)果卻轉(zhuǎn)到了一種新的分子。但這在科學(xué)研究中是經(jīng)常發(fā)生的。開始的時(shí)候，你做非常基礎(chǔ)的研究，嘗試去解答一些普遍的生物學(xué)問題，然后經(jīng)常性地發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新性的應(yīng)用，并帶來新的技術(shù)，就像基因組編輯一樣。

 

《知識(shí)分子》：那下一步做些什么？

 

斯克斯尼斯：當(dāng)然，正如你所見，Cas9被用到不同的模式生物中做基因編輯，Cas9也被用于不同的領(lǐng)域，從基礎(chǔ)的生物學(xué)領(lǐng)域到生物技術(shù)到醫(yī)學(xué)。但是，如果你回到細(xì)菌中，會(huì)發(fā)現(xiàn)仍然有很多抵御病毒的防御系統(tǒng)現(xiàn)在還沒人知道是如何工作的。所以，研究細(xì)菌如何抵抗噬菌體仍然是很有趣的，可能你會(huì)發(fā)現(xiàn)里面藏著新的有用的工具，這就是科學(xué)發(fā)展的模式。

 

對CRISPR技術(shù)的態(tài)度將影響基礎(chǔ)研究

 

《知識(shí)分子》：歐洲和美國對待基因編輯技術(shù)的態(tài)度似乎不同？

 

斯克斯尼斯：歐洲法院認(rèn)為任何生物，使用了CRISPR和Cas9編輯技術(shù)，那么就可以被認(rèn)定是轉(zhuǎn)基因生物。但美國的判斷完全不同。他們的監(jiān)管部門認(rèn)為CRISPR只是基因編輯的一種技術(shù)，不能認(rèn)為使用了CRISPR編輯的生物都是轉(zhuǎn)基因生物。這是由于兩邊對程序的看法不同。美國那邊可能是看最后的結(jié)果。因?yàn)镃RISPR可以精準(zhǔn)地做編輯，所以你可以對基因組進(jìn)行精確的操作，你完全知道你對生物做了什么。使用CRISPR技術(shù)得到了想要的作物，而且從結(jié)果上無法區(qū)分產(chǎn)物和用傳統(tǒng)方法得到的作物有任何不同，比如傳統(tǒng)的植物育種。而歐洲的看法則不同，他們更看重過程。你使用了基因編輯技術(shù)，更改了基因組，Cas9也是這種技術(shù)的一種，因此使用Cas9編輯的生物應(yīng)該被看做轉(zhuǎn)基因生物。這完全是兩種不同的策略。

 

《知識(shí)分子》：所以你同意這是一種對技術(shù)的誤解？

 

斯克斯尼斯：這是不同的策略，但歐洲的做法最后可能會(huì)有些問題，因?yàn)楹茈y用相同的規(guī)則去套用不同的技術(shù)，因?yàn)槿绻夹g(shù)改變了，那規(guī)則就無所適從。

 

《知識(shí)分子》：你認(rèn)為這會(huì)對基礎(chǔ)研究產(chǎn)生影響嗎？

 

斯克斯尼斯：我覺得這些政策很可能對基礎(chǔ)研究產(chǎn)生負(fù)面影響，尤其對歐洲的科學(xué)家。相比美國科學(xué)家來說，我們很可能錯(cuò)過一些重要的技術(shù)轉(zhuǎn)化工作。（對于更多的影響，）我們將拭目以待。

 

《知識(shí)分子》：現(xiàn)在科學(xué)界、政策制定者和普通民眾對轉(zhuǎn)基因的態(tài)度已經(jīng)有巨大的鴻溝。我們接觸的每一個(gè)科學(xué)家?guī)缀醵紩?huì)說轉(zhuǎn)基因技術(shù)是安全可控的，而政策制定者通常持懷疑態(tài)度，而普通民眾通常會(huì)說我不想嘗試這個(gè)。你覺得問題出在什么地方？同樣的事情出現(xiàn)在了CRISPR技術(shù)上，你作為一個(gè)科學(xué)家如何看待這件事？

 

斯克斯尼斯：正如你所說，科學(xué)家對轉(zhuǎn)基因技術(shù)有清晰的看法，他們不認(rèn)為這項(xiàng)技術(shù)有什么問題，因?yàn)樗麄兝斫饧夹g(shù)背后的整個(gè)過程，也知道轉(zhuǎn)基因生物是如何被創(chuàng)造出來的。顯然我們已經(jīng)有了足夠長時(shí)間的觀察，我們也沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因生物對健康和其它方面產(chǎn)生了任何影響。但是，對普通民眾來說，他們覺得問題很大。我們需要科學(xué)界和科學(xué)家與普通民眾更多的溝通。我們需要多站出來解釋我們的工作，比如解釋CRISPR技術(shù)是怎么一回事。正如我現(xiàn)在跟你的交流，可能我也是在和中國讀者解釋我們的工作。

 

《知識(shí)分子》：所以你覺得科學(xué)家，尤其是在這個(gè)領(lǐng)域工作的科學(xué)家，需要更直率的交流？

 

斯克斯尼斯：是的，可能需要這樣，需要和大眾以及媒體多交流。

 

《知識(shí)分子》：所以我們交流地越多，大眾也會(huì)越接受？

 

斯克斯尼斯：沒錯(cuò)，完全同意。當(dāng)人們互相交流時(shí)，很多問題就消失了。許多話題包括轉(zhuǎn)基因技術(shù)，都可以通過對話解決。

 

《知識(shí)分子》：非常謝謝您接受采訪。

 

人物簡介

 

 

維吉尼亞斯·斯克斯尼斯，立陶宛維爾紐斯大學(xué)教授。

 

1956年1月26日，斯克斯尼斯出生立陶宛北部的古老城市?iauliai，并在那里長大。

 

在中學(xué)，斯克斯尼斯對數(shù)學(xué)，物理和化學(xué)很感興趣，并參加了全國化學(xué)競賽和一些國際賽事。之后，他進(jìn)入維爾紐斯大學(xué)化學(xué)系，并對有機(jī)化學(xué)著了迷。1978年，斯克斯尼斯獲維爾紐斯大學(xué)有機(jī)化學(xué)碩士學(xué)位。1983，他獲得莫斯科國立大學(xué)酶動(dòng)力學(xué)博士學(xué)位?；仡櫜┦康膶W(xué)習(xí)，斯克斯尼斯認(rèn)為，莫斯科國立大學(xué)當(dāng)時(shí)可能是前蘇聯(lián)做博士研究的最佳場所，當(dāng)時(shí)很多化學(xué)家轉(zhuǎn)為生化學(xué)家，他們對化學(xué)反應(yīng)的生物化學(xué)動(dòng)力學(xué)和機(jī)制非常了解。

 

之后，他回到維爾紐斯大學(xué)應(yīng)用酶學(xué)研究所做初級研究員（博士后）。1990年，立陶宛獨(dú)立，也放開了更多的科學(xué)合作。抓住這次機(jī)會(huì)，斯克斯尼斯與布里斯托大學(xué)的Steven Halford等限制酶生化研究領(lǐng)域的專家合作。

 

1993年，斯克斯尼斯前往位于德國馬克斯·普朗克生物化學(xué)研究所的Robert Huber（諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主）實(shí)驗(yàn)室做訪問學(xué)者。

 

1995年，他開始擔(dān)任維爾紐斯大學(xué)生物技術(shù)研究所蛋白質(zhì)-DNA相互作用部主任、主席科學(xué)家。過去是二十多年的時(shí)間里，斯克斯尼斯主要研究核酸代謝酶（限制性內(nèi)切酶）的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。 2007年起，他開始研究CRISPR-Cas的機(jī)制，成為最先闡明Cas9蛋白可編程的DNA切割功能的科學(xué)家之一。

 

2016年，斯克斯尼斯與埃馬紐埃爾·夏彭蒂耶、詹妮弗·A·杜德納、Rodolphe Barrangou和Philippe Horvath共同獲得沃倫·阿爾珀特獎(jiǎng)（Warren Alpert Foundation Prize）。

 

2016年，他成為歐洲分子生物學(xué)組織（EMBO）成員。

 

 2018年，斯克斯尼斯與埃馬紐埃爾·夏彭蒂耶、詹妮弗·A·杜德納共同獲得卡弗里納米科學(xué)獎(jiǎng)（Kavli Prize in Nanoscience）。