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斑馬魚模型用于研究人類基因功能的一般策略

發(fā)布時(shí)間:

2018-12-06

斑馬魚模型用于研究人類基因功能的一般策略

作為優(yōu)選的模式脊椎動物，斑馬魚模型可以用來評價(jià)人類基因的作用與功能、解析其在遺傳與

發(fā)育上發(fā)揮作用的分子機(jī)制。如果候選基因與疾病高度相關(guān)，斑馬魚模型則可以用來幫助確認(rèn)疾病

的致病基因，通過基因組改造（基因敲除、敲入和轉(zhuǎn)基因等）構(gòu)建人類疾病的斑馬魚模型，表型模

擬人類疾病的病癥，進(jìn)而用于研究分子遺傳病的病理機(jī)制、篩選治療疾病的化學(xué)藥、開發(fā)基因治療

的生物藥等生物醫(yī)藥的研發(fā)。

一、在斑馬魚胚胎中過表達(dá)目標(biāo)基因（野生型vs 突變型等位基因）評價(jià)基因功能（暫時(shí)性）

如果目標(biāo)基因在人類疾病中過表達(dá)，或者想了解突變基因可能的功能（包括功能缺失或功能獲

得），可以通過借助顯微注射技術(shù)在斑馬魚胚胎中過表達(dá)目標(biāo)基因（野生型vs 突變型等位基因，

基本方法為：克隆人類目標(biāo)基因、體外轉(zhuǎn)錄制備mRNA，將mRNA 顯微注入斑馬魚受精卵），將斑

馬魚胚胎當(dāng)作一個(gè)體內(nèi)反應(yīng)器，建立暫時(shí)性的體內(nèi)模型，從胚胎顯微行為學(xué)、顯微形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等不同水平評價(jià)目標(biāo)基因的功能及可能的作用機(jī)制。具體的評價(jià)策略需在對目標(biāo)基因的個(gè)性化特征分析后確定。我們已有的工作積累表明，轉(zhuǎn)錄組分析是一種常用的比較有效的機(jī)制解析策略，通過選擇發(fā)育至合適時(shí)期的注射胚胎（需結(jié)合基因的特征進(jìn)行評價(jià)后選擇），提取總RNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，從而有機(jī)會在轉(zhuǎn)錄組水平上無偏好地整體評價(jià)目標(biāo)基因的功能（包括但不限于對特定生物學(xué)過程的影響、對特定信號通路的影響、對特定基因的可能調(diào)控作用）。基于上述研究目的時(shí)，即使待研究的人基因在斑馬魚中沒有同源基因，也可以根據(jù)已知目標(biāo)基因的保守生物學(xué)功能（只要斑馬魚胚胎也存在類似的生物學(xué)過程），利用斑馬魚胚胎評價(jià)其功能。

二、在斑馬魚胚胎中敲降目標(biāo)基因評價(jià)人同源基因功能（暫時(shí)性）

如果目標(biāo)基因在斑馬魚基因組中有直系同源基因，那么就可以在斑馬魚胚胎中敲降目標(biāo)基因，

評價(jià)人同源基因功能。如果選擇敲降目標(biāo)基因的話，需要首先明確目標(biāo)基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中有表達(dá)。如果目標(biāo)基因在早期胚胎中沒有表達(dá)，毫無疑問敲降斑馬魚的同源基因，不可能獲得有用的信息。目標(biāo)基因在斑馬魚上的早期表達(dá)，可通過RT-PCR 和胚胎整體原位雜交來檢測。RT-PCR 可以給出基因的發(fā)育時(shí)期特異性的表達(dá)模式（但缺乏組織特異性或空間特異性表達(dá)信息），而胚胎整體原位雜交則可以獲得時(shí)空特異性表達(dá)的全部信息。至于目標(biāo)基因如果存在a 和b 兩個(gè)拷貝的情況，建議首先通過原位雜交確認(rèn)那個(gè)拷貝的表達(dá)模式可能與感興趣的發(fā)育事件有關(guān)，如果胚胎整體原位雜交結(jié)果表明兩個(gè)基因均與可能與感興趣的發(fā)育事件有關(guān)，則需要同時(shí)敲降（一般安排敲降a、敲降b、敲降a+b 三組實(shí)驗(yàn)）。在實(shí)踐工作中，還可能遇到斑馬魚的同源基因只是預(yù)測的結(jié)果，在這種情況下，需要首先克隆該基因（CDS 全序列）或至少該基因的部分CDS 序列（可借組于EST 序列信息）。在確定目標(biāo)基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中有表達(dá)后，需要建立基因敲降的方法。斑馬魚基因敲降（knock down）策略為：1）使用兩個(gè)MO，其中一個(gè)與AUG 附近序列互補(bǔ)，抑制mRNA 翻譯，該MO 無需驗(yàn)證有效性（活性），其是否具有活性只能通過敲降后的胚胎表型來確定；另一個(gè)與內(nèi)含子-外顯子連接處序列互補(bǔ)，抑制原始mRNA 的剪接，該MO 的有效性（活性）可以通過RT-PCR加以確認(rèn)；而兩個(gè)MO 的特異性通常是通過設(shè)計(jì)相應(yīng)的5-堿基錯(cuò)配MO 作為對照來實(shí)現(xiàn)的；2）MO

加CRISPRi，其中的MO 為前述可抑制原始mRNA 的剪接的MO，CRISPRi 方法則是通過多個(gè)sgRNA

（一般建議4 個(gè)）引導(dǎo)dCas9 抑制目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的敲降；無論哪一種策略，

只有在兩種敲降方法得出的表型一致，且其異常表型可被mRNA 拯救的情況下，才可以被認(rèn)定敲降

結(jié)果可靠。一般地，推薦使用策略2，因?yàn)椴呗? 中的兩種方法一個(gè)在轉(zhuǎn)錄后水平、一個(gè)在轉(zhuǎn)錄水

平（且一般認(rèn)為CRIPSRi 的脫靶和毒性小于MO），因而結(jié)果的可信度更高。在確認(rèn)了基因敲降的方法后，可以前述同樣的策略評價(jià)基因的功能及解析可能的分子機(jī)制。即：從胚胎顯微行為學(xué)、顯微形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等不同水平評價(jià)目標(biāo)基因的功能及可能的作用機(jī)制。具體的評價(jià)策略需在對目標(biāo)基因的個(gè)性化特征分析后確定。我們已有的工作積累表明，轉(zhuǎn)錄組分析是一種常用的比較有效的機(jī)制解析策略，通過選擇發(fā)育至合適時(shí)期的注射胚胎（需結(jié)合基因的特征進(jìn)行評價(jià)后選擇），提取總RNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，從而有機(jī)會在轉(zhuǎn)錄組水平上無偏好地整體評價(jià)目標(biāo)基因的功能（包括但不限于對特定生物學(xué)過程的影響、對特定信號通路的影響、對特定基因的可能調(diào)控作用）。

三、構(gòu)建基因敲除斑馬魚模型研究目標(biāo)基因的功能（永久性）

如果期待通過功能缺失解析基因功能，那么構(gòu)建基因敲除斑馬魚模型則是一種常見的選擇?；?/div>

因敲除的方法包括CRISPR/Cas9 或者TALEN，常用CRISPR/Cas9。功能研究方案同前。

四、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型研究目標(biāo)基因的功能（永久性）

如果期待通過功能獲得解析基因功能，那么制備轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型則是一種常見的選擇。轉(zhuǎn)基

因方法為Tol2 策略。功能研究方案同前。

五、構(gòu)建基因敲入斑馬魚模型研究目標(biāo)基因的功能（永久性）

人類分子遺傳病中很多是源于點(diǎn)突變或者小片段插入缺失造成的基因突變。在這種情況下，構(gòu)

建基因敲入斑馬魚模型研究目標(biāo)基因的功能是一種常見的選擇。要建立基因敲入模型，首先要進(jìn)行

氨基酸水平上的保守性分析。只有氨基酸水平上是高度保守的，才可以考慮基因敲入（相對而言，

這種保守性在不少直系同源基因上并不好）。

另外，還需要特別提醒的是：目前斑馬魚的基因敲入技術(shù)非常不成熟，基因敲入的成本高且風(fēng)